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細胞培養常見問題分析

 


華拓細胞常見問題
 
1.血清中可能出現的沉淀物是什么? 
  基于多年的實驗研究,用于細胞培養的胎牛血清以及其它血清中可能會存在以下種類的沉淀物:(1)纖維蛋白,它是經常出現的較大的沉淀物,可以達到 1-2mm,可以用肉眼觀察到。 因為血清都是在低溫下進行收集和快速處理的,一些纖維蛋白原(可溶性的形成絮狀纖維蛋白的前體)在處理過程中仍然處于溶解狀態,當經過最后的過濾分裝后,就會在瓶中凝結出現纖維蛋白沉淀。(2)磷酸鈣,它也是常見的一種沉淀物,通常會使血清出現渾濁,并且在 37℃ 培養的時候會增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點,這些小黑點由于布朗運動看上去可以活動,因此經常被誤認為是微生物污染。(3)膽固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白質。他們也是血清中出現沉淀物的常見原因。
 
2.血清中的沉淀物對細胞培養有什么影響? 
(1)細胞生長。我們的試驗以及經驗表明沉淀物不會影響細胞培養,我們的客戶以及其它血清生產商也證明了這一點。
(2)過濾。如果血清中出現大量的沉淀物,血清將很難過濾。一般說來,因為在血清生產時最后已經經過 100nm 或者 40nm 的過濾處理,并且經過了嚴格的無菌檢測,因此不推薦再過 濾用于細胞培養的血清。在實驗室中沒有必要再過濾處理血清,在大觃模的細胞培養中往往將血清直接加到培養基中一起過濾。
(3)污染。磷酸鈣往往被誤認為微生物污染而引起爭端,研究者可能會在血清中觀察到一些絮狀的沉淀,因此就會比較警覺的去做無菌試驗,將血清放在培養箱中培養幾天,結果可能會觀察到更多的絮狀沉淀,因此就斷定血清被污染了。并且當研究者將血清樣品放在倒置顯微鏡下觀察時往往可以看到一些可以運動的小黑點,因此就更加確認是血清被污染了。于是,研究者就會花費更多的時間和精力來和生產商確認,但最終確定血清沒有被污染而只是沉淀。為了避免這些問題的發生,我們建議不要直接將血清放在培養箱中培養觀察是否有菌,而是將血清加到瓊脂板上進行培養以觀察是否有細菌生長。另外,也可以進行革蘭氏染色,在油鏡下觀察,以確認是否有污染。
 
 
3.如何避免血清中沉淀物的出現?
  首先要注意正確的血清解凍步驟,而且溶解過程中一定要每隔一段時間均勻而緩慢的搖動血清。我們已經發現在下列情況下沉淀物可能增加,使用中應該盡量避免:
(1)熱滅活血清;
(2)在 37℃下培養血清;
(3)反復凍融;
(4)γ射線照射;
(5)長期儲存在 2-8℃;
(6)在室溫下放置時間過長
 
4.如何去除血清中的沉淀?
  如想去除這些絮狀沉淀物,可以將血清分裝到無菌離心管中,以400g 離心,上清液即可直接加入到培養基內一起過濾。注意:不要以過濾的方式去除這些絮狀沉淀物,因為這可能阻塞濾膜。
 
5.冷凍管應如何解凍?
  取出冷凍管后,須立即放入 37°C 水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內全部融化,并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全,預防冷凍管爆裂。
 
6.細胞冷凍管解凍培養時,是否應馬上去除 DMSO?
  除少數特別注明對 DMSO 敏感的細胞外,絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞),在解凍后,應直接放入含有 10-15ml 新鮮培養基的培養角瓶中,待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。
 
7.一般客戶拿到細胞后,應該注意什么?
  客戶收到細胞先不開蓋,放在培養箱靜置若干小時后(看細胞密度而定)在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,并對細胞進行不同倍數拍照(建議受收細胞時的培養基拍一張照片,觀察培養基的顏色和是否有漏液情況,顯微鏡下拍細胞 100X,200X 各一張),排除細胞本身污染的情況;收到細胞未開封,出現污染狀況我們負責免費發送一株細胞。 收到細胞時如無異常情況,請在顯微鏡下觀察細胞密度,如為貼壁細胞,未超過 80%匯合度時,將培養瓶中培養液吸出,留下 10ml 培養液繼續培養;超過 80%匯合度時,請按細胞培養條件傳代培養。如為懸浮細胞,吸出培養液、1000 轉/分鐘離心 2 分鐘,吸出上清,管底細胞用新鮮培養基懸浮細胞后移回培養瓶。
  細胞消化液建議使用 PBS 配制,慎用 Hanks 液配制。
 
8.快遞細胞多久能到,是寄凍存的細胞還是復蘇好的細胞?
  我們采用快遞發貨,一般外地 2--3 天,寄細胞前請確認當地溫度,如果氣溫低于 4 度的,則采用郵寄凍存細胞。
 
9.如何用臺盼蘭計數活細胞?
   用無血清培養基把細胞懸液稀釋到 200~2000 個/毫升,在 0.1 毫升的細胞懸液中加入0.1 毫升的 0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數分鐘后,用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭,因而染成藍色的細胞是死細胞。
 
10.細胞培養過程中,選用華拓推薦的培養體系,還需要添加其他細胞因子等培養試劑嗎?
   不需要。如特殊需,我公司技術人員會提前告之。
 
11.可否使用與原先培養條件不同的血清種類?
   不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源,所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。
 
12.何謂 FBS,FCS,CS,HS?
   FBS(fetalbovineserum)和 FCS(fetalcalfserum)是相同的意思,兩者都是指胎牛血清,FCS 乃錯誤的使用字眼,請不要再使用。CS(calfserum)則是指小牛血清。HS(horseserum)則是指馬血清。
 
13.L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?
   L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。
 
14.培養細胞時應使用 5%或 10%CO2?或根本沒有影響?
   一般培養基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統,而培養基中 NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的 CO2 濃度。當培養基中NaHCO含量為每公升3.7g時,細胞培養時應使用10% CO2;當培養基中NaHCO3為每公升1.5g時,則應使用5% CO2培養細胞。
 
15.何時須更換培養基? 
   視細胞生長密度而定,或遵照細胞株基本數據上的更換時間,按時更換培養基即可。
 
16.Hoechst 33258  Hoechst 33342 都能染核,二者區別是什么? 
   Hoechst 33342,也稱 bisBenzimide H 33342 或 HOE 33342。分子式為 C27H28N6O •3HCl•3H2O,分子量為 615.99。Hoechst 33258,也稱bisBenzimide H 33258 或 HOE 33258。分子式為 C25H24N6O•3HCl,分子量為 533.88。兩種染料都是一種可以穿透細胞 膜的藍色熒光染料,對細胞的毒性較低。但是hoechst 33342 對細胞的毒性作用更小一些, 33258 穿透能力較 33342 弱,染活細胞時容易被"泵出",也就是拒染。所以一般來說 hoechst 33258 用于細胞固定后再染色,而 hoechst33342 則可以對活細胞直接進行染色。
 
17.附著性細胞繼代時所使用的 trypsin-EDTA 濃度?應如何處理? 
   一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為 0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次開瓶后應 立即少量分裝于無菌試管中,保存于–20°C,避免反復冷凍解凍造成trypsin 的活性降低,并 可減少污染的機會。
 
18.懸浮性細胞應如何繼代處理? 
   一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中,稀釋細胞濃度即可,若培養液太多時,可 將培養角瓶口端稍微抬高,直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞的培養液至另一新的 培養角瓶,加入新鮮培養基稀釋至適當濃度,重復前述步驟即可。
 
19.欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應為多少轉速?
   欲回收動物細胞,其離心速率一般為 300xg(約 1000rpm),5-10 分鐘,過高的轉速,將造成細胞死亡。
 
20.細胞的接種密度為何?
   依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的一重要原因。
 
21.細胞冷凍培養基的成份為何?
   動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含 5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原來細胞生長用的新鮮培養基均勻混合的。注意:由于 DMSO 稀釋時會放出大量熱能,故不可將 DMSO 直接加入細胞液中,必須使用前先行配制完成。
 
22.DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何?
   冷凍保存使用的 DMSO 等級,必須為 Tissueculturegrade 的 DMSO(如 SigmaD2650),其本身即為無菌狀況,第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于 4°C,避免反復冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質,并可減少污染的機會。若要過濾 DMSO,則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質濾膜。
 
23.冷凍保存細胞的方法?
   冷凍保存方法一:冷凍管置于 4°C 30-0 分鐘→(-20°C30 分鐘*)→-80°C16~18 小時(或隔夜)→液氮槽 vaporphase 長期儲存。冷凍保存方法二:冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降 1-3°C 至–80°C 以下,再放入液氮槽 vaporphase 長期儲存。*-20°C 不可超過 1小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
 
24.細胞欲冷凍保存時,細胞冷凍管內應有多少細胞濃度?
 冷凍管內細胞數目一般為 1x106cells/mlvial,融合瘤細胞則以 5x106cells/mlvial 為宜。
 
25.應如何避免細胞污染?
   細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染的血清和污染的細胞等。嚴格的無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好的細胞來源和培養基配制是減低污染的最好方法。
 
26.如果細胞發生微生物污染時,應如何處理?
   直接滅菌后丟棄。
 
27.支原體(mycoplasma)污染的細胞,是否能以肉眼觀察出異狀?
   不能。除極有經驗的專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株,無法以其外觀分辨的。
 
28.支原體污染會對細胞培養有何影響?
   支原體污染幾乎可影響所有細胞的生長參數,代謝及研究的任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為 mycoplasma-free,實驗結果的數據方有意義。
 
29.偵測出細胞株有支原體污染時,該如何處理?
   直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。
 
30.CO2 培養箱的水盤如何保持清潔? 
   定期(至少每兩周一次)以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換。
 
31.為何培養基保存于 4°C 冰箱中,顏色會偏暗紅色,且 pH 值會越來越偏堿性? 
   培養基保存于 4°C 冰箱中,培養基內的 CO2 會逐漸溢出,造成培養基越來越偏堿性。而 培養基中的酸堿指示劑(通常為 phenolred)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿的結果,將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時,可以通入無菌過濾的 CO2,以調整 pH 值。
 
32.各種細胞培養用的 dish,flask 是否均相同? 
   不同廠牌的 dish 或 flask,其所 coating 的 polymer 不同,制造程序亦不同,雖對大部 分細胞沒有太大的影響,惟少數細胞則可能因使用廠牌不同的 dish或 flask 而有顯著的生長 差異。
 
33.購買的細胞冷凍管經解凍后,為何會發生細胞數目太少的情形? 
   研究人員在冷凍細胞的培養時出現細胞數目太少,大都是因為離心過程操作上的失誤,造 成細胞的物理性損傷,以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心,應待細胞生長隔夜后再 更換培養基即可。

34.購買的d細胞死亡或細胞存活率佳可能原因? 
 研究人員在細胞培養時出現存活率不佳,常見原因可歸納為:培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后,加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80°C 太久。
 
35.收到的冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落的原因?
   冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,乃因熱脹冷縮的物理現象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

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